【摘要】目的觀察染料木素的體外抗腫瘤作用。方法采用溴化3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑(3-［4,5-dimethylthiazol-2-yl］-2,5-diphenyltetrazoliumbromide,MTT)檢測(cè)法測(cè)定染料木素對(duì)子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞系（JEC）、人肝癌SMMC-7721細(xì)胞系體外增殖的影響，按臺(tái)盼藍(lán)排染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。結(jié)果MTT法檢測(cè)顯示，染料木素對(duì)JEC細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性；隨染料木素濃度的升高，JEC和SMMC-7721細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線逐漸下移，10-4mol·L-1的染料木素作用下的JEC細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈現(xiàn)與5Fu相似的下降趨勢(shì)。結(jié)論染料木素具有一定的抗腫瘤作用。
【關(guān)鍵詞】染料木素腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)
1材料與方法
1.1MTT檢測(cè)法
1.1.1腫瘤細(xì)胞的傳代培養(yǎng)子宮內(nèi)膜腺癌（JEC，遵義醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室吳中明教授提供）、人肝癌SMMC7721（中科院上海生命研究院）用含10%小牛血清的RPMI－1640(Lot#1165062,GIBCO)培養(yǎng)液稀釋成1×105·ml－1的細(xì)胞懸液，每個(gè)培養(yǎng)瓶2ml，置３７℃、５％的CO2環(huán)境中進(jìn)行體外培養(yǎng)，待瘤細(xì)胞在培養(yǎng)瓶底長(zhǎng)至約８０％細(xì)胞融合時(shí)，分瓶傳代培養(yǎng)。
1.1.2分組實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組（NS）、陽性對(duì)照組（5-fliorouracil，5Fu，10-4mol·L-1。上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號(hào)：031001），5個(gè)10倍梯度的試藥組（10-4～10-8mol·L-1的染料木素，﹥95%，陜西賽德高科生物股份有限公司）和與10-4mol·L-1的染料木素相對(duì)應(yīng)的溶媒對(duì)照組（含0.5%乙醇的NS）。
1.1.3操作用RPMI-1640完全培養(yǎng)液分別將腫瘤細(xì)胞稀釋配制成5×104·ml－1的細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，置37℃,5%的CO2環(huán)境中，進(jìn)行體外培養(yǎng)，24h后加藥，每孔10μl，設(shè)5個(gè)平行孔，空白對(duì)照組加入等量生理鹽水；結(jié)束培養(yǎng)（24，48，72，96h）前4h，每孔加入5mg·ml－1的MTT溶液10μl，結(jié)束培養(yǎng)后小心吸棄上清液，每孔加入DMSO150μl，待甲臢完全溶解后于酶標(biāo)儀（Sunrise,Australia）570nm處讀出各孔的OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.1.4評(píng)價(jià)指標(biāo)評(píng)價(jià)指標(biāo)為平均細(xì)胞抑制率(IR)。細(xì)胞抑制率（%）=(1一實(shí)驗(yàn)孔OD值/對(duì)照孔OD值)×100％。IR>50％為敏感，在30％～50％為低度敏感，小于30％為不敏感。
1.2臺(tái)盼藍(lán)排染法及生長(zhǎng)曲線的繪制將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成濃度為5×104·ml－1細(xì)胞懸液，接種于24孔板，每孔1ml。置37℃,5%的CO2環(huán)境中培養(yǎng)24h，再行無血清培養(yǎng)48h。更換完全培養(yǎng)基，每孔加入藥物100μl（空白對(duì)照組加等體積的生理鹽水），每組各時(shí)間點(diǎn)均設(shè)2個(gè)平行孔。分別于藥物作用1～7d，消化收集細(xì)胞，按臺(tái)盼藍(lán)排染法，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在光鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，活細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用±s表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行各組間比較。
2結(jié)果
2.1MTT檢測(cè)
2.1.1染料木素對(duì)JEC細(xì)胞體外增殖的影響MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，隨染料木素濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，染料木素對(duì)JEC細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用逐漸增強(qiáng)。結(jié)果見表1。其中，10-4mol·L-1的染料木素作用JEC細(xì)胞24，48，72和96h的抑制百分率分別為36.10%，55.00%，58.73%和62.21%，與5Fu間無顯著差異（P>0.05）。表1染料木素對(duì)JEC細(xì)胞體外增殖的影響(略)
2.1.2染料木素對(duì)SMMC-7721細(xì)胞體外增殖的影響MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著染料木素濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，染料木素對(duì)SMMC-7721的抑制作用逐漸增強(qiáng)。結(jié)果見表2。表2染料木素對(duì)SMMC7721細(xì)胞體外增殖的影響(±略)
2.2染料木素對(duì)JEC和SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
2.2.1染料木素對(duì)JEC細(xì)胞生長(zhǎng)的影響染料木素對(duì)JEC細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線顯示，隨著染料木素濃度的增加，生長(zhǎng)曲線逐漸下移，10-4mol·L-1染料木素的生長(zhǎng)曲線呈現(xiàn)與5Fu相似的`下降趨勢(shì)。見圖1。
2.2.2染料木素對(duì)SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)的影響染料木素對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線顯示，隨著染料木素濃度的增加，生長(zhǎng)曲線逐漸下移。見圖2。
3討論
MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，染料木素對(duì)JEC和SMMC-7721細(xì)胞體外增殖均有不同程度的抑制作用，呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性。其中，在96h10-4mol·L-1的染料木素對(duì)JEC細(xì)胞的抑制百分率達(dá)62.21%，對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的抑制百分率為31.87%。表明染料木素對(duì)JEC細(xì)胞敏感，對(duì)SMMC-7721低度敏感。該結(jié)果與染料木素對(duì)胃癌HGC227細(xì)胞系［6］、人肺癌細(xì)胞A549和人低分化胃腺癌細(xì)胞BGC-823［7］等的抑制作用相似。隨著染料木素濃度的增加，JEC和SMMC-7721細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線均逐漸下移。其中，在10-4mol·L-1的染料木素作用下，JEC細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線呈現(xiàn)與5Fu相似的下降趨勢(shì)，進(jìn)一步表明染料木素具有一定的抗腫瘤作用。
染料木素是一種很有潛力的癌癥化學(xué)預(yù)防劑，來源豐富，作用復(fù)雜，受到廣泛關(guān)注。研究表明，染料木素具有雌激素作用、抗氧化作用以及抑制拓樸異構(gòu)酶活性、抑制酪氨酸蛋白激酶活性、誘發(fā)細(xì)胞程序性死亡、抑制血管生成［2］等作用，但仍不能完全闡明其作用機(jī)制。染料木素抗腫瘤的機(jī)制有待深入研究。
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